江口萝卜猪是中国宝贵的地方遗传资源保护品种之一，主要分布于贵州省东北部铜仁地区，主产于江口县桃映乡、民和乡、怒溪乡和坝盘乡，其中以桃映乡最为集中，其具有耐粗饲、适应性强、易育肥、屠宰率高、肉品质好等优良特性，深受当地人民的喜爱(惠嫣婷等, 2014)。脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding proteins, FABPs)是脂结合蛋白超家族成员，是一类分子量小，具有高亲和力的可溶性蛋白质，在脂肪酸的摄取、转运及代谢调控中发挥重要作用，其广泛分布于哺乳动物的脂肪、肌肉、肝脏、心肌、小肠等组织细胞中(蒋金津等, 2009)。迄今为止，已分离并鉴定出9种类型的脂肪酸结合蛋白，其中肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP，又称FABP1)、肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP，又称FABP2)、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP，又称FABP3)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP，又称FABP4)是该家族中较常见的4种(徐海霞等, 2008, 畜牧与兽医, 40(1): 94-97 )。单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism site, SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异而引起DNA序列的改变，一些SNPs位于蛋白质编码区会影响翻译后氨基酸的关键功能基团，进而影响蛋白质的结构及相关功能。脂肪酸结合蛋白是影响脂肪沉积的重要基因，对机体脂肪代谢有调控作用，其基因多态性对揭示体脂变化规律具有重要意义(陈璐, 2013)。姜延志等(2006)对4个猪种的L-FABP基因进行SNPs检测并分析其遗传多态性与肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)含量之间的相关性，结果表明L-FABP基因可能是影响猪IMF的主效基因；Chamberlain等(2009)研究表明，人I-FABP基因第2外显子第54位点SNP与脂代谢密切相关，其突变型I-FABP提高与长链脂肪酸的亲和力，致使机体吸收更多脂类从而使血脂水平升高；郭松长(2003)对8个猪群体的H-FABP基因遗传多态性进行研究，结果表明H-FABP基因多态性对猪生长、肉质性状有一定影响；Gerbens等(2001)对不同猪群体的A-FABP基因多态性进行研究，结果表明该基因的SNPs与肌内脂肪含量显著相关。基于此，本研究以江口萝卜猪为材料，利用DNA池与测序技术对猪脂肪酸结合蛋白主要家族基因L-FABP、I-FABP、H-FABP、A-FABP的外显子序列进行SNPs检测，并作生物信息学分析，为研究其基因对脂肪沉积的影响奠定基础，同时为江口萝卜猪的选种与保种工作提供理论依据。

1结果与分析

1.1猪肌肉组织DNA提取

提取DNA后用l%琼脂糖凝胶电泳检测，基因组DNA条带整齐，经紫外分光光度计检测，其OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6~1.8范围内，表明基因组DNA提取效果较佳，可用于后续PCR扩增。

1.2 脂肪酸结合蛋白主要家族基因的PCR扩增

PCR扩增后，取5μL的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增片段与目的片段大小一致，条带单一，表明引物特异性较好(图1)。

图1 PCR扩增电泳图

1.3扩增基因的测序

对测序结果进行比对筛查出7个SNP位点(图2)：以第一外显子为基准，在FABP1基因的第一内含子1745bp处发生T→C突变，在第二外显子125bp处发生T→C突变，在第二外显子131bp处发生A→C突变，在第二外显子153bp处发生C→A突变，分别将其命名为intron1-T1745C、exon2-T125C、exon2-A131C、exon2-C153A。其中exon2-T125C 、exon2-C153A 为同义突变；exon2-A131C为错义突变，由谷氨酸(Glu)替换为丙氨酸(Ala)；在FABP2基因第二外显子65bp处发生A→T突变，命名为exon2-A65T，其为错义突变，由赖氨酸(Lys)替换为甲硫氨酸(Met)；在FABP3基因第二外显子40bp处发生G→A突变，命名为exon2-G40A，其为错义突变，由谷氨酸(Glu)替换为赖氨酸(Lys)；在FABP4基因的第三内含子65bp处发生C→T突变，将其命名为intron3-C65T。

图2 测序及BLAST分析结果

1.4 SNPs等位基因频率估算

利用MWSnap软件的标尺分别测量FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因的各SNPs等位基因峰高，根据公式估算SNPs等位基因频率(表1)。由表可知，等位基因频率在突变前后有差异。除了FABP3基因exon2-G40A位点突变前后等位基因频率差异较小外，其余SNPs突变前后均有明显差异。

表1 等位基因频率估算

1.5 mRNA二级结构分析

对引起错义突变的exon2-A131C、exon2-A65T、exon2-G40A位点进行mRNA二级结构预测结果表明，SNP位点突变前后引起mRNA二级结构改变，并且导致RNA二级结构自由能发生改变(图3)。其中exon2-A131C位点突变前后的自由能由 -125.76 kcal/mol变为-130.36 kcal/mol；exon2-A65T位点突变前后的自由能由 -148.27 kcal/mol 变为-148.69 kcal/mol；exon2-G40A位点突变前后的自由能由-142.25 kcal/mol变为 -140.76 kcal/mol。RNA二级结构和自由能的改变均会影响其结构的稳定性，进而可能会影响后续蛋白质翻译过程及其相关功能的表达。

图3 RNA二级结构变化结果

1.6蛋白质二级结构分析

   分别对突变位点exon2-A131C、exon2-A65T、exon2-G40A进行蛋白质二级结构分析结果表明，exon2-G40A位点突变前后的β-转角、α-螺旋、无规卷曲、扩展链均有所改变；exon2-A131C和exon2-A65T位点突变前后的β-转角、α-螺旋、扩展链有所改变，而无规卷曲不变(表2)。

表2 蛋白质突变前后二级结构分析

1.7蛋白质突变前后三级结构分析

进行突变前后蛋白质三级结构预测和分析，对了解蛋白质结构及其相关功能具有重要意义。利用蛋白质三级结构预测软件对exon2-A131C、exon2-A65T、exon2-G40A位点突变前后的蛋白质结构进行分析结果表明，exon2-A131C位点碱基分别为A、C对应氨基酸为谷氨酸(Glu)和丙氨酸(Ala)时，exon2-A65T位点碱基分别为A、T对应氨基酸为赖氨酸(Lys)和甲硫氨酸(Met)时，以及exon2-G40A位点碱基分别为G、A对应氨基酸为谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Lys)时，其蛋白质三维结构突变前后均有所改变(图4)。

图4 蛋白质三级结构变化

2讨论

    在影响猪肉品质的众多因素中，肌内脂肪(IMF)是一个极其重要的指标，其与肉品质呈正相关，主要影响肉的嫩度、风味及多汁性。研究结果表明，2%~3%的肌内脂肪含量是优质猪肉的理想标准，当肌内脂肪含量低于2%时，肉的质地和口感均较差(祝仁铸等, 2013)。近年来，国内外对猪的选育一直倾向于更大程度上提高瘦肉率，导致肌内脂肪降低，严重影响猪肉品质，忽略了保持一定肌内脂肪含量的重要性。因此，在保证瘦肉率的同时，提高肌内脂肪含量成为育种工作者新的研究领域。脂肪酸结合蛋白家族(FABPs)对脂肪代谢具有重要意义，尤其是在调节肌内脂肪含量方面起着关键作用(郭瑞, 2006)，特别是H-FABP和A-FABP基因被学者们作为研究影响肌内脂肪含量的候选基因，其表达量与肌内脂肪含量呈正相关(陈志辉, 2006)。FABPs主要通过改变与脂肪酸代谢有关酶的活性，增加脂肪酸在膜间的转运，影响细胞内信号转导和基因转录及介导激素作用等途径调节机体脂肪酸代谢(Nakata, 2003)。在现代畜牧业生产上，将FABPs基因的优势基因型作为后代选育的参考和依据，可提高动物生产性能，改善畜产品品质，能更好地满足消费者对畜产品更高的要求。目前，研究者们采用分子生物学方法从分子水平上对FABPs功能进行多方面研究，对更深入了解脂肪酸结合蛋白家族基因对动物机体脂肪的代谢调控具有深远意义(Her et al, 2004; Jiang et al, 2006)。

本研究对江口萝卜猪FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因进行SNP多态位点检测，共筛查出7个SNPs。其中intron1-T1745C、intron3-C65T分别在FABP1和FABP4基因的内含子上，由于内含子在转录过程中被剪接去除，在大多数真核结构基因中不编码序列，对翻译产物的结构无意义，因此其突变位点能否会对基因转录翻译过程造成一定影响还需要进行更深入的研究探讨；在FABP1基因外显子上的exon2-T125C 、exon2-C153A 多态位点未引起对应氨基酸序列的改变，为同义突变；在FABP1、FABP2、FABP3基因外显子上的exon2-A131C、exon2-A65T、exon2-G40A多态位点都引起了编码氨基酸的改变，为错义突变，对应的氨基酸改变分别为：由谷氨酸(Glu)替换为丙氨酸(Ala)，由赖氨酸(Lys)替换为甲硫氨酸(Met)，由谷氨酸(Glu)替换为赖氨酸(Lys)。对引起错义突变的3个多态位点分别进行突变前后的生物信息学分析。其多态位点等位基因频率估算结果表明等位基因频率在突变前后有较大差异；mRNA二级结构分析结果表明SNP位点突变前后引起mRNA二级结构改变，并且导致其自由能发生改变；蛋白质二级、三级结构预测分析结果表明，突变前后的二级结构和三级结构均有较明显改变，表明多态位点可能通过影响氨基酸序列，从而影响相关蛋白质的高级结构，进而影响其对应的相关调控功能。其SNPs对探究基因多态位点与猪脂肪沉积的相关性具有科学意义，为阐明脂肪酸结合蛋白主要家族基因FABP1、FABP2、FABP3、FABP4在猪机体脂肪沉积代谢途径中的调控机理奠定理论基础。

3材料与方法

3.1 DNA的提取及DNA池的构建

江口萝卜猪肌肉组织样采自江口县江口萝卜猪繁育中心。采用磁珠法动物组织基因组DNA抽提试剂盒提取江口萝卜猪肌肉组织DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，经紫外分光光度计检测每个DNA样品浓度，加双蒸水调整 45个DNA样品浓度至100 ng/μL，各取10 μL构建DNA池。

3.2特异性引物设计

从NCBI数据库中获得猪FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因DNA序列(GenBank登录号分别为：NC_010445 、NC_010450、NC_010448、NC_010446)，利用Primer-BLAST针对每个基因的每个外显子分别设计1对特异性引物，共14对，引物信息见表3。

表3 引物序列, 目的片段长度及退火温度

3.3 DNA扩增测序

    PCR扩增得到FABP1、FABP2、FABP3、FABP4基因外显子序列。PCR反应体系为40 μL：2×Taq PCR Master Mix试剂20 μL，上、下游引物各2.0 μL，基因组DNA 4 μL、双蒸水12 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；退火30 s，退火温度参见上表3；72 ℃延伸30 s；循环35个后72 ℃终延伸10 min。扩增的PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过凝胶成像仪拍照并记录结果。

3.4序列测序及分析

扩增的PCR产物委托上海英骏生物技术有限公司纯化后双向测序，利用DNAStar软件对测序结果进行校正比对，结合BLAST分析确定SNPs。

3.5 SNPs峰高测量及等位基因频率估算

利用DNAStar中的SeqMan软件查看测序结果，并利用MWSnap测量各多态位点等位基因的对应峰高。通过如下公式估算各等位基因频率(Suliman et al., 2003)。

A_і=B_і/(B_a+B_b),і=a,b

式中A_і表示某多态位点等位基因频率，B_a和B_b分别代表测序图上其SNP等位基因a、b峰高。

3.6突变前后多态位点生物信息学分析

利用http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi软件进行mRNA二级结构预测；

利用https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html软件进行蛋白质二级结构预测；

利用http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index软件进行蛋白质三级结构预测。

作者贡献

盘道兴为本研究试验执行者，完成了试验操作、数据整理与分析及论文撰写；杨茂林，廖乔平，杨昌平，吴宇萍与盘道兴共同完成了样品采集和数据分析工作，王振、谢海强协助论文修改工作；刘若余为本研究项目负责人，负责实验指导及论文修改。

致谢

    本研究由贵州省农业攻关项目(黔科合NY[2014]3045号)和贵州省科技富民强县项目 《江口萝卜猪养殖及深加工技术集成与示范》 (黔科合县市科技计划[2012]7024 号)共同资助。贵州大学动物科学学院张依裕副教授对本研究的指导和帮助，在此表示诚挚感谢。

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